| |
(Laporan Pratikum Mikrobiologi)
Oleh :
VIYAN KRISTIANTO
E1A210063
Kelompok 6
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS LAMBUNG MANGKURAT
BANJARBARU
2011
| |
Halaman
DAFTAR ISI ............................................................................................. i
DAFTAR TABEL ..................................................................................... ii
DAFTAR GAMBAR ................................................................................ iii
PENDAHULUAN .................................................................................... 1
TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... 3
BAHAN DAN METODE ........................................................................ 13
Bahan dan Alat........................................................................................... 13
Bahan................................................................................................... 13
Alat ..................................................................................................... 13
Tempat dan Waktu .................................................................................... 13
Prosedur Kerja ........................................................................................... 13
HASIL DAN PEMBAHASAN................................................................. 16
Hasil ........................................................................................................... 16
Pewarnaan Gram ................................................................................. 16
Perhitungan Jumlah Konidia ............................................................... 16
Pembahasan ............................................................................................... 17
Pewarnaan Gram ................................................................................. 17
Perhitungan Jumlah Konidia ............................................................... 18
KESIMPULAN.......................................................................................... 20
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 21
| |
Halaman
Tabel 1. Perbedaan Antara Gram Positif dan Gram Negatif ..................... 11
Tabel 2. Karakteristik Gram Positif dan Gram Negatif ............................. 11
Tabel 3. Hasil Praktikum Uji Gram ............................................................ 16
| |
Halaman
Gambar 1. Pewarnaan Sederhana .............................................................. 10
Gambar 2. Pewarnaan Negatif ................................................................... 10
Gambar 3. Pewarnaan Gram ...................................................................... 11
Gambar 4. Haemocytometer Mikroskopis ................................................. 18
| |
Mikroba dapat kita jumpai pada seluruh lingkungan lingkungan normal maupun ekstrim. Setiap mikroba membutuhkan kondisi lingkungan tertentu terkait dengan karakter morfologi dan biokimia (metabolisme) yang dimilikinya. Oleh karena itu, lingkungan hidup suatu mikroba akan berbeda – beda dan ada kalanya hanya spesifik untuk mikroba tertentu.
Dalam suatu lingkungan, tidak dapat dihindari bahwa mikro akan selalu berinteraksi dengan organisme lain, baik dengan kelompoknya sendiri maupun dari kelompok lain. Kondisi lingkungan yang kompleks telah membentuk suatu pola interaksi dengan organisme lain.
Mikroba memiki berbagai peran penting dalam suatu ekosistem. Peran ini bisa diemban dalam kapasitasnya sebagai organisme tunggal (sel atau koloni) maupun dalam kaitannya sebagai organisme yang memiliki kebutuhan dan kemampuan untuk berinteraksi dengan organisme lain.
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu bakteri yang hidup akan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Sedangkan, untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu, bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah sedangkan yang positif berwarna ungu (Levine, 2000).
Praktikum persiapan pembuatan apusan dan teknik pewarnaan gram sangat penting dilakukan karena untuk pengamatan biakan dari koloni mikroba dan biakan jamur dapat dilakukan dengan mudah dan baik. Pewarnaan ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospora yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Pelczar dan Chan, 2007).
Tujuan dari praktikum ini adalah mengetahui cara membedakan bakteri gram positif dan gram negative serta mengetahui cara perhitungan jumlah konidia dengan haemocytometer.
| |
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. Bentuk bakteri bermacam – macam yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan, 2007).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO?. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991).
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).
Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, salah satu di antaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna terdapat pada ion positif (zat pewarna+ Cl-) dan pada pewarna asam, warna akan terdapat pada ion negatif (zat pewarna- Na+). Hubungan antara bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa, Kristal violet, safranin dan metilin blue adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa digunakan. Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai bakteri dengan zat pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna (Volk & Wheeler, 1993).
Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter kebangsaan Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna tersebut merupakan pewarna differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua kelompok fisiologi, yang akan memudahkan untuk identifikasi. Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah memberi pewarna kristal violet, setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna yodium, setelah satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95% selama 30 detik, kemudian dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta warna merah) selama 1 menit. Zat pewarna kristal violet dan yodium akan membentuk senyawa yang kompleks. Beberapa bakteri akan melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci dan beberapa bakteri yang lain zat pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan alkohol 95%. Bakteri gram positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri gram negatif akan terwarna merah (safranin) (Umsl, 2008).
Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan Ziehl‐Nelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus, Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan bakteri Gram negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram negative adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella, Hemophillus, dll (Cappuccino & Sherman, 1983).
Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium, alkohol dan safranin (Tracy, 2005).
Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol, maka pori‐pori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alkohol. Hal ini akan mengecilkan pori‐pori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki 1‐2 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih besar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet, Aalkohol, Ammonium oksalat, Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide, Aquades), Gram C (Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades). Pewarnaan ZN digunakan untuk mengidentifikasi infeksi yang disebabkan oleh bakteri tahan asam, conttohnya adalah Micobacteriom tuberculosis, Micobacterium leprae, Mycobacterium atypical seperti Mycobacterium avium intraseluler / Mycobacterium avium complex yang tumbuh pada 41C yang menyerang sistem imun, Mycobacterium marinum dan Mycobacterium ulcerans yang tumbuh pada 31C dan menginfeksi kulit, Nocardia, Legionella mycdatci, Rhodococcus, Tsukamurella, Gordonia / Gordona, Cryptosporidium, Isospora, Cyclospora, Sarcocytis, dll. Contoh bakteri than asam yang tidak cocok pada pewarnaan ZN tetapi cocok pada Kinyoun adalah Nycordia, Rhodococcus, Tsukamurella, dan Gordonia. Hasil pewarnaan ZN akan mengidentifikasikan : 1. Bakteri tahan asam Bakteri tahan asam baru akan terkarakterisasi setelah pewarnaan setelah pemberian asam‐ alkohol. Hasilnya berwarna merah. 2. Bakteri tidak tahan asam Hasilnya adalah berwarna biru karena dekolorisasi pada pewarnaan pertama oleh asam‐alkohol, jadi perlu diberi pewarnaan kedua berupa counter stain. Sifat tahan asam pada bakteri tahan asam disebabkan karena dinding selnya terdiri atas peptidoglikan, arabinogalaktan, dan lipid (50%‐nya tersusun atas asam mikolat). Asam mikolat merupakan asam lemak ranai panjang yang terdiri atas 34‐90 karbon. Pewarnaan ZN terdiri dari ZN‐A (merah) (Basic fusion, Alcohol, Fenol, Aquades), ZN‐B (tidak berwarna) (HCl, Etil alcohol), dan ZN‐C (biru) (Methylen blue, Aquades) (Madigan, 2003).
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut: pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam), pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul, pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan Neisser (granula volutin), pewarnaan yodium (granula glikogen) dan pewarnaan negatif (Gozali, 2009).
Pada umumnya jarang atau tidak terjadi kebingungan dalam memutuskan adanya lender atau tidak meskipun beberapa kultur bereaksi secara lambat. Namun jika bakteri yang dicampur terlalu sedikit, dikhawatirkan hasilnya akan salah. Lebih baik pada saat melakukan uji ini menggunakan latar belakang warna hitam. Metode ini tidak disarankan pada kultur yang berusia beberapa minggu.
Dari uraian diatas dapat dinyatakan bahawa penentuan sifat gram dengan KOH 3% (disebut KOH string test) memiliki hasil yang sama dengan pewarnaan gram. Keunggulannya jelas terlihat yaitu sederhana, praktis, dan tidak time-consuming. Namun kekurangannya antara lain:
Dari uraian diatas dapat dinyatakan bahawa penentuan sifat gram dengan KOH 3% (disebut KOH string test) memiliki hasil yang sama dengan pewarnaan gram. Keunggulannya jelas terlihat yaitu sederhana, praktis, dan tidak time-consuming. Namun kekurangannya antara lain:
1. Tidak dapat sekaligus mengecek morfologi selnya sehingga tidak dapat mengetahui adanya kontaminan pada kultur yang tidak diketahui jenisnya.
2. Kultur (sel) yang digunakan lebih banyak daripada pewarnaan gram. Hal ini akan menimbulkan masalah jika bakteri uji memiliki koloni tunggal yang kecil dan adapula yang merekat dengan agar.
3. Tidak dapat mendeteksi gram variabel (telah dijelaskan).
Bagaimana bisa berlendir.
Bagaimana bisa berlendir.
Secara teoretis gram (+) memiliki dinding sel yang tebal dan lemak yang tipis sedangkan gram (-) berlemak tebal dan berdinding sel tipis yang berada di ruang periplasma. KOH akan menyerang lemak (bilayer lipid) ini dan membuat sel gram (-) pecah. Pecahnya sel melepaskan materi genetik (DNA) yang merupakan substansi melimpah di dalam sel bakteri. Molekul DNA sangat panjang bersifat sticky strings (menyerupai lendir, getah atau dapat berarti lengket) yang memberikan hasil seperti lendir saat diangkat dengan jarum inokulum (Indra, 2009).
Gambar 1. Pewarnaan Sederhana (Gozali, 2009)
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiotomo, 1990).
Gambar 2. Pewarnaan Negatif (Hadiotomo, 1990)
Gambar 3. Pewarnaan Gram (Jason, 2009).
Tabel 1. Perbedaan Antara Gram Positif dan Gram Negatif (Madigan dan Martinko, 2006).
| No. | Aspek Perbedaan | Gram Positif | Gram Negatif |
| 01. | Struktur Dinding Sel | Tebal (15-80 nm) dan berlapis tunggal | Tipis (10-15 nm) dan berlapis tiga |
| 02. | Komposisi Dinding Sel | Kandungan lipid rendah (1-4 %) Peptidoglikan merupakan lapisan tunggal. Komponen utama merupakan > 50 % berat kering sel bakteri. Mengandung asam teikoat | Kandungan lipid tinggi (11-22 %). Peptidoglikan merupakan lapisan kaku sebelah dalam. Komponen utama merupakan kurang lebih 50 % berat kering dan tanpa asam teikoat. |
| 03. | Kerentanan terhadap Fenisilin | Lebih rentan | Kurang resisten |
| 04. | Resistensi terhadap gangguan fisik | Lebih resisten | Kurang resisten |
| 05. | Kepekaan terhadap Streptomisin | Tidak peka. | Peka. |
Tabel 2. Karakteristik Bakteri Gram Positf dan Gram Negatif(Madigan & Martinco, 2006).
| No. | Karakteristik | Gram Positif | Gram Negatif |
| 01. | Bentuk Sel | Bulat, batang atau filamen | Bulat, oval, batang lurus atau melingkar seprti tand koma, heliks atau filamen, beberapa mempunyai selubung atau kapsul |
| 02. | Repruduksi | Pembelahan biner | Pembelahan biner, kadang-kadang pertunasan |
| 03 | Metabolisme | Kemoorganoheterotrof | Fototrof, kemolitoautotrof, atau kemoorganoheterotrof |
| 04. | Motilitas | Kebanyakan nonmotil, bila motil tipe flagelanya adalah petritrikus (petritrichous). | Motil atau nonmotil. Bentuk flagela dapat bervariasi seperti polar, lopotrikus (lophtrichous), petritrikus (petritrichous). |
| 05. | Anggota tubuh (apendase) | Biasanya tidak memiliki apendase | Dapat memiliki pili, fimbriae, tangkai |
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Edwin, 2011).
Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel.
Banyak spesies bakteri gram negatif yang bersifat patogen, yang berarti berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram negatif, terutama lapisan lipopoli sakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin) (Edwin, 2011).
| |
Bahan dan Alat
Bahan
Bahan – bahan yang digunakan yakni berbagai macam isolate bakteri dan jamur, KOH dan aquades.
Alat
Alat – alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah mikroskop, hemacytometer, jarum ose, slide glass, cover glass, tabung reaksi, shaker dan pipet tetes.
Tempat dan Waktu
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin, tanggal 12 Desember 2011, pukul 11.50 – 13.30 WITA, di Laboraturium Fitopatologi Fakultas Pertanian Universitas lambung Mangkurat, Banjarbaru.
Prosedur Kerja
A. Menghitung langsung konidia jamur secara mikroskopis
1. Sapkan tabung reksi berisi 9 ml aquades steril (3 Buah).
2. Tandailah tabung A, B, C yang berisi aqudes steril.
3. Kocok suspense jamur/bakteri yang akan dihitung jumlahnya dan dipindahkan 1 ml suspense ke tabung A.
4. Kocok tabung A sehingga konidia jamur tersebar dan terlepas dari kelompok atau rantainya.
5. Pindahkan 1 ml dari tabung A ketabung B, kemudian kocok.
6. Pindahkan 1 ml dari tabung B ke tabung C, kemudian kocok.
7. Dari tabung C diambil 0,1 ml dan dengan cermat taruhlah pada lekukan berbentuk V pada tepi ada cairan masuk di antara kaca penutup, karena hal tersebut akan menambah kedalaman cairan dibawah kaca penutup yang sebenarnya harus berukuran tepat 0,1 ml. Bila sampai terjadi hal demikian, maka seluruh prosedur harus diulang kembali dari awal.
8. Taruhlah hemacytometer diatas meja objek. Amatilah dengan lensa objektif berkekuatan rendah dan hitunglah jumlah konidium yang terdapat pada 5 kotak besar yang terletak di dalam kotak bagian tengah yang berukuran 1 mm2.
9. Contoh perhitungan : jika pada pengamatan anda terdapat 50 konidium jamur didalam 5 kotak besar, maka jumlah konidium jamurr yang terdapat didalam setiap ml suspensi asal dapat dihitung dengan cara sebagai berikut:
a. Dalam 25 kotak besar (1 mm3) terdapat 50 x 5 atau 250 konidium jamur.
b. Karena kedalaman cairan dibawah hemacytometer ialah 0,1 ml, maka volume cairan pada kotak berukuran 1 mm2 adalah 0,1 mm3 artinya terdapat 250 konidium/0,1 mm3 atau 2500 konidium/mm3.
c. Jumlah konidium jamur yang terdapat didalam suspensi pada tabung C adalah 2,5 x 107 konidium/ml.
d. Jumlah konidium jamur yuang terdapat didalam suspensi asal pada botol adalah 2,5 x 1010 konidium/ml.
B. Uji Gram
1. Inokulum bakteri diambil menggunakan jamrum ose yang diletakkan pada tetesan larutan KOH 3 %.
2. Inokulum diaduk selama 5-10 detik dan kemudian jarum ose diangkat keatas dari tetesan tadi.
3. Bila larutan KOH menjadi kental dan cairan mengikuti jarum ose sampai 0,5-2 cm saat jarum ose diangkat, hal ini menunjukkan bakteri yang diperiksa adalah gram negatif, sebaliknya bila cairan tidak mengikuti jarum ose maka bakteri yang diperiksa adalah gram positif.
| |
Hasil
Pewarnanaan Gram
Tabel 3. Hasil Praktikum Uji Gram
| No | Sampel | Hasil Uji Gram | Indikasi |
| 1 | Isolat Bakteri | Gram Positif | Bakteri ikut larut tidak lengket |
| 2 | Isolat Jamur | Gram Positif | Bakteri ikut larut tidak lengket |
Perhitungan Jumlah Konidia
Dalam praktikum ini, perhitungan kerapatan konidia jamur sebagai berikut :
Diketahui :
T = 74
N = 9
Rumus :
3288,89
3289*
(*) Pembulatan dilakukan karena spora jumlahnya tidak berkoma.
Pembahasan
Pewarnaan Gram
Hasil pengujian diatas menunjukkan bahwa metode KOH umumnya menghasilkan hasil yang sama dengan metode pewarnaan gram tapi metode KOH tidak dapat menentukan sifat gram variabel. Gram variabel dalam pewarnaan gram ditampakkan dengan beberapa sel berwarna ungu dan lainnya merah jingga. Bakteri gram variabel yang diuji dengan KOH dapat menghasilkan gram (+) atau (–) seperti kelompok Coryneform (Corynebacterium, Arthrobacter dll). Dari kelompok ini beberapa terlihat gram (+) dan yang lain gram (–) (berlendir sedikit) menggunakan metode KOH.
Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70% agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat perlakuan, kemudian bakteri yang akan dikonfirmasi diambil sebanyak satu ose dan diletakkan pada gelas obyek yang telah terdapat larutan KOH sebanyak satu jarum ose, konfirmasi dilakukan untuk memastikan bakteri tersebut gram negatif atau positif. Kemudian campurkan dengan mengaduknya, kemudian jarum ose diangkat beberapa sentimeter untuk mengetahui apakah cairan berlendir atau tidak. Jika cairan tersebut berlendir maka bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif dan jika cairan tersebut tidak berlendir maka bakteri tersebut bakteri gram positif.
Perhitungan Jumlah Konidia
Jumlah konidia jamur dapat dihitung dengan menggunakan alat hitung Haemocytometer.
I I I
V
III IV
Gambar 4. Haemocytometer Mikroskopis
Kotak I, II, III, IV, dan V adalah contoh kotak yang akan dihitung jumlah konidianya. Kotak ini terletak pada keempat sudutnya yang ditambahkan satu pada tengahnya. Setiap kotak berisi 16 kotak kecil. Pada alat hitung tertera standart yaitu :
L = 0,00025 mm2 dan t = 0,1 mm, dimana L = Luas dan t = tinggi
Maka isinya : L x t = 0,00025 mm2 x 0,1 mm = 25 x 10-6 mm3
Hasil kerapatan konodia dari praktikum ini adalah 3.289.
Rumus perhitungan konidia:
Keterangan :
Q = Kerapatan konidia
T = Banyaknya konidia yang dihitung
N = Banyaknya kotak kecil yang diamati (5 x 16 kotak = 80 kotak)
D = Faktor pengenceran (d = 10 ml)
Dalam praktikum ini ditemukan konidia yang tampak dibawah lensa mikroskop dengan menggunakan haemacytometer pada sampel tabung B. Jumlah konidia tersebut dapat dihitung secara matematis menggunakan rumus Q = , dimana Q merupakan jumlah seluruh konidia pada suatu pengenceran, t adalah jumlah konidia pada suatu tabung dan n adalah jumlah kotak pada haemacytometer, maka diperoleh perhitungan sebagai berikut :
Q =
Q =
Q = 3288.9
| |
1. Dalam 2-3 tetes air sample, terdapat ratusan banyaknya koloni jamur.
2. Kecepatan dan tingkat pertumbuhan konidia jamur sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor pendukung, diantaranya suhu dalam suatu perairan tersebut, tingkat intensitas cahaya yang diperoleh dan media – media pendukung lainnya.
3. Karena ukuran konidia jamur sangat kecil, sehingga dalam proses perhitungannya sulit ditentukan dengan pasti berapa jumlah pengenceran yang dilakukan.
| |
Cappuccino, J. G. & Natalie. S. 1983. Microbiology A Laboratory Manual. Addison-Wesley Publishing Company, New York.
Edwin. 2011. Materi Kuliah Mikrobiologi. Universitas Lambung Mangkurat. Banjarbaru. Kalimantan Selatan.
Gozali. Amir. 2009. Pewarnaan gram. http://www.gozali.blogspo.com/gram/pewarnaan-gram-prinsip.html. Diakses pada tanggal 19 Desember 2011 di Banjarbaru.
Hadiotomo, Ratna Siri., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Pt Gramedia.
Indra Pradhika. 2009. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2009/05/penentuan-sifat-gram-dengan-koh-3-dan.html. Diakses pada tanggal 19 Desember 2011 di Banjarbaru.
Jason. 2009. The Gram Stainning. http://astro.temple.edu/~jasoncg/ID/ microreporting.htm. Diakses pada tanggal 19 Desember 2011 di Banjarbaru.
Levine, M. 2000. An Introduction to Laboratory Technique in Bacteriology. McMillan Company, New York.
Madigan, M.T. 2003. Brock Biology of Microorganism. Pearson Education, inc. United State of America.
Madigan dan Martinco. 2006. Brock Biology of Microorgnisms. New Jersey Pearson Prentice Hall. London, English.
Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book Company. New York.
Sutedjo, M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta. Jakarta.
Tracy. 2005. Gram Staining. www.tracy.k12.ca.us/thsadvbio/pdfs/gram%20stain.pdf. Diakses pada tanggal 19 Desember 2011 di Banjarbaru.
Umsl. 2008. Staining Bacteria. www.umsl.edu/~microbes/pdf/stainingbacteria.pdf. Diakses pada tanggal 19 Desember 2011 di Banjarbaru.
Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga. Jakarta
Waluyo, L . 2007 . Mikrobiologi Umum . Universitas Muhammadiyah Malang Press. Malang.
0 komentar:
Posting Komentar